Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un método de análisis fisicoquímico de referencia para la separación, identificación y cuantificación de los componentes de mezclas complejas. Gracias a su precisión, reproducibilidad y versatilidad, la HPLC se utiliza de forma rutinaria y en desarrollo en numerosos sectores industriales, como el farmacéutico, el cosmético, el de alimentos y bebidas, el químico, el medioambiental, el de materiales y el de polímeros.
¿Qué es HPLC?
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC ) se basa en la separación de los analitos de una muestra según su interacción con una fase estacionaria contenida en una columna y una fase móvil líquida (disolvente o mezcla tamponada). Permite la identificación y cuantificación de constituyentes a bajas concentraciones, incluyendo trazas, mediante detectores adaptados a la naturaleza de los compuestos.
Un análisis por HPLC genera un cromatograma , donde el eje x representa el tiempo y el eje y la señal del detector. Cada compuesto separado aparece como un pico, que puede utilizarse para su identificación y cuantificación.
Principio y pasos de un análisis HPLC
Durante un análisis, la muestra disuelta se inyecta en un circuito de fase móvil activado por una bomba de alta presión. Al pasar por la columna, los compuestos se separan según sus respectivas afinidades por las fases estacionaria y móvil. Tras la elución, el detector mide los analitos y un sistema de adquisición de datos procesa los datos para obtener e interpretar el cromatograma.
Un análisis HPLC normalmente incluye los siguientes pasos: circulación de la fase móvil, inyección de la muestra, separación en la columna, detección de analitos y luego generación y procesamiento del cromatograma.
Cómo funciona la cromatografía HPLC
Un sistema HPLC consta de varios módulos integrados:
- Bomba de alta presión: permite que la fase móvil circule por la columna (hasta 400 bares).
- Inyector de muestras: ya sea manual o automatizado, la inyección debe ser precisa y reproducible.
- Columna cromatográfica: corazón de la separación, rellena de una fase estacionaria (sílice modificada, resinas de intercambio…).
- Detector: UV/Vis, diodo array (DAD), fluorescencia, refractometría o acoplado a espectrometría de masas (HPLC-MS).
- Sistema de adquisición y procesamiento de datos: conversión de señales en cromatogramas utilizables.
La elección del método cromatográfico depende de la naturaleza de la muestra y de los objetivos analíticos:
- Fase reversa (RP-HPLC) : la más común, con una fase estacionaria hidrófoba
- Fase normal , intercambio iónico , exclusión por tamaño , etc.
Detectores de HPLC y selección de detección
La elección del detector depende de la estructura química, el nivel de concentración esperado y la matriz.
La detección UV/Vis y DAD son adecuadas para numerosos ensayos rutinarios donde los compuestos absorben en el rango UV. La fluorescencia ofrece alta sensibilidad para analitos fluorescentes o derivatizados. El índice de refracción es útil para compuestos con baja o nula absorción UV, como ciertas familias de azúcares, polioles o polímeros solubles. El ELSD es adecuado para compuestos no volátiles con baja absorción UV. Se recomienda su combinación con espectrometría de masas, en LC-MS o LC-MS/MS, cuando la confirmación de identidad, la selectividad y la sensibilidad a trazas son cruciales.
¿Para qué matrices?
La cromatografía líquida de alto rendimiento es adecuada para una amplia gama de matrices:
Características técnicas de la HPLC
- Rango de presión : hasta 400 bar
- Modos de separación : isocrático o gradiente
- Tipos de columnas : sílice C18, C8, intercambio iónico, permeación en gel…
- Detectores : UV/Vis, DAD, fluorescencia, RI, MS
- Sensibilidad : detección de trazas (ppm a ppb)
- Normas relacionadas : USP 621, Ph. Eur. 2.2.29, ICH Q2(R1)
Principales aplicaciones industriales
La HPLC se utiliza de forma rutinaria o en desarrollo en muchos sectores industriales:
HPLC y UHPLC, ¿cuál es la diferencia?
La UHPLC, a veces llamada UPLC, representa un avance tecnológico que busca mejorar la resolución y reducir los tiempos de análisis mediante el uso de partículas más finas y presiones operativas más altas. Dependiendo de la complejidad de la muestra y los objetivos, la UHPLC puede ser relevante para acelerar los análisis y mejorar la separación.
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Léa Géréec
Experto técnico y científico
