Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est une méthode d’analyse physico-chimique de référence pour la séparation, l’identification et la quantification des composants d’un mélange complexe. Grâce à sa précision, sa reproductibilité et sa polyvalence, la HPLC est utilisée en routine et en développement dans de nombreux secteurs industriels, notamment le pharmaceutique, le cosmétique, l’agroalimentaire, la chimie, l’environnement, les matériaux et les polymères.
Qu'est-ce que la HPLC ?
La HPLC (high performance liquid chromatography), également appelée chromatographie liquide haute performance, repose sur la séparation des analytes d’un échantillon selon leur interaction avec une phase stationnaire contenue dans une colonne et une phase mobile liquide (solvant ou mélange tamponné). Elle permet d’identifier et de quantifier des constituants à de faibles concentrations, y compris à l’état de traces, en s’appuyant sur des détecteurs adaptés à la nature des composés.
Une analyse HPLC se traduit par un chromatogramme, où l’axe des x correspond au temps et l’axe des y au signal fourni par le détecteur. Chaque composé séparé apparaît sous forme de pic, exploitable pour l’identification et la quantification.
Principe et étapes d’une analyse HPLC
Lors d’une analyse, l’échantillon dissous est injecté dans un circuit de phase mobile mis en mouvement par une pompe haute pression. En traversant la colonne, les composés se séparent en fonction de leurs affinités respectives pour la phase stationnaire et la phase mobile. Après élution, les analytes sont mesurés par le détecteur, puis les données sont traitées par un système d’acquisition qui permet d’obtenir et d’interpréter le chromatogramme.
Une analyse HPLC comprend généralement les étapes suivantes : mise en circulation de la phase mobile, injection de l’échantillon, séparation dans la colonne, détection des analytes, puis génération et exploitation du chromatogramme.
Fonctionnement de la chromatographie HPLC
Un système HPLC est constitué de plusieurs modules intégrés :
- Pompe haute pression : permet de faire circuler la phase mobile à travers la colonne (jusqu’à 400 bars).
- Injecteur d’échantillon : manuelle ou automatisée, l’injection doit être précise et reproductible.
- Colonne chromatographique : cœur de la séparation, remplie d’une phase stationnaire (silice modifiée, résines échangeuses…).
- Détecteur : UV/Vis, diode array (DAD), fluorescence, réfractométrie ou couplé à la spectrométrie de masse (HPLC-MS).
- Système d’acquisition et traitement des données : conversion des signaux en chromatogrammes exploitables.
Le choix du mode chromatographique dépend de la nature de l’échantillon et des objectifs analytiques :
- Phase inverse (RP-HPLC) : le plus courant, avec une phase stationnaire hydrophobe
- Phase normale, échange d’ions, exclusion stérique, etc.
Détecteurs HPLC et choix de la détection
Le choix du détecteur dépend de la structure chimique, du niveau de concentration attendu et de la matrice.
La détection UV/Vis et DAD est adaptée à de nombreux dosages de routine lorsque les composés absorbent dans l’UV. La fluorescence offre une sensibilité élevée pour des analytes fluorescents ou dérivatisés. L’indice de réfraction est utile pour des composés peu ou pas absorbants en UV, par exemple certaines familles de sucres, polyols ou polymères solubles. L’ELSD est adapté aux composés non volatils et faiblement absorbants en UV. Le couplage à la spectrométrie de masse, en LC-MS ou LC-MS/MS, est recommandé lorsque la confirmation d’identité, la sélectivité et la sensibilité à l’état de traces sont critiques.
Pour quelles matrices ?
La chromatographie liquide haute performance s’adapte à une très large gamme de matrices :
Caractéristiques techniques de la HPLC
- Plage de pression : jusqu’à 400 bars
- Modes de séparation : isocratique ou gradient
- Types de colonnes : silice C18, C8, échange d’ions, gel perméation…
- Détecteurs : UV/Vis, DAD, fluorescence, RI, MS
- Sensibilité : détection de traces (ppm à ppb)
- Normes associées : USP 621, Ph. Eur. 2.2.29, ICH Q2(R1)
Applications industrielles principales
La HPLC est utilisée en routine ou en développement dans de nombreux secteurs industriels :
HPLC et UHPLC, quelle différence ?
L’UHPLC, parfois appelée UPLC, correspond à une évolution technologique visant à améliorer la résolution et réduire les temps d’analyse grâce à des particules plus fines et des pressions de fonctionnement plus élevées. Selon la complexité de l’échantillon et les objectifs, une approche UHPLC peut être pertinente pour accélérer les analyses tout en améliorant la séparation.
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YesWeLab vous accompagne pour définir une stratégie d’analyse HPLC adaptée à votre objectif, qu’il s’agisse de contrôle qualité, de conformité, d’étude de stabilité, d’investigation en cas de non-conformité ou de développement de méthode. En fonction des exigences de sélectivité et de sensibilité, une méthode en HPLC peut être complétée par une UHPLC ou un couplage LC-MS/MS.
Après cadrage, YesWeLab sélectionne le laboratoire partenaire le plus adapté à votre matrice, votre secteur et votre famille de composés, en privilégiant les périmètres accrédités lorsque cela est pertinent. Vous bénéficiez d’une gestion centralisée des informations, du suivi des échantillons et de la restitution des résultats.
Les livrables peuvent inclure les résultats quantitatifs, les chromatogrammes, les conditions de séparation et les performances associées, en fonction du cahier des charges défini en amont.
Léa Géréec
Référente technique et scientifique
